Иммуногистохимический анализ экспрессии TGF-β1 в почках крыс на модели воздействия сероводорода и циклоспорина А

Патоморфологические изменения, развивающиеся в почках при патологическом старении, характеризуются полиморфизмом [1, 2]. Они включают метаплазию, сенесценцию и разнообразные формы клеточной гибели [3, 4].

Запрограммированная клеточная гибель и различные варианты остановки клеточного цикла, сопровождающие этот процесс, не всегда свидетельствуют о патологическом характере, а могут быть признаками физиологического ремоделирования ткани [5]. Нарушение же элиминации дисфункциональных клеток и хроническое воспаление приводят к накоплению сенесцентных клеток, для которых остановка клеточного цикла становится необратимой [6, 7].

Сенесценция может быть инициирована различными стрессовыми сигналами, включая воздействие активных форм кислорода, экзогенных и эндогенных токсинов [8–10]. Исследования на моделях генномодифицированных мышей с выключением гена ингибитора циклин-зависимой киназы 1A ( англ. cyclin-dependent kinase inhibitor 1A, Cdkn1a ), кодирующего протеин 21 ( англ. protein 21, p21), показали, что отсутствие сенесценции компенсируется активацией апоптотических механизмов, однако это приводит к нарушению нормальной дифференцировки тканей, проявляющемуся в признаках дисплазии у потомства [11]. В то же время данный маркер отражает остановку клеточного цикла, но не обязательно устойчивую сенесценцию: остановка может быть временной, а экспрессия р21 кратковременной.

Часто при возраст-ассоциированных заболеваниях повышается уровень лизосомального фермента SA-β-gal[1] , но он не связан функционально с механизмами сенесценции, может повышаться при других состояниях (дифференцировке макрофагов), часто дает ложноположительные результаты, зависит от условий окрашивания (pH[2] среды) и используется только на свежезамороженном материале [12].

Достаточно специфической особенностью сенесцентных клеток является секреция провоспалительных цитокинов, факторов роста и протеаз, среди которых особое место занимает трансформирующий фактор роста β1 ( англ. transforming growth factor β1, TGF-β1), действие которого связано с экспрессией циклин-зависимых киназных ингибиторов (p15Ink4b, p21, p27), что приводит к остановке клеточного цикла [13]. Кроме того, TGF-β1 способствует окислительному стрессу, ингибирует теломеразу и запускает другие процессы, хорошо известные как индукторы сенесценции [14, 15]. Маркер не только указывает на наличие сенесценции, но и участвует в ее поддержании и распространении [16, 17].

Весь этот широкий спектр синтеза биологически активных веществ объединяется понятием «сенесцентного секреторного фенотипа» ( англ. senescence-associated secretory phenotype, SASP). Особенно наглядно это проявляется в почках, где сенесцентные клетки активно взаимодействуют с микроокружением путем секреции различных сигнальных молекул, модулируя поведение фибробластов, эпителиальных и иммунных клеток, тем самым поддерживая хроническое воспаление [18].

Несмотря на то, что механизмы сенесценции интенсивно изучаются во всем мире, особенностей развития дисфункции почек при патологическом старении, вызванном токсическими (как сероводород (англ. hydrogen sulfide, H2S)) или иммуносупрессирующими (как циклоспорин А ( англ. cyclosporine A, CsA) воздействий в доступной литературе крайне мало [1, 3, 19, 20, 21].

Цель настоящего исследования оценить влияние H2S и CsA, как отдельно, так и в комбинации, на экспрессию TGF-β и развитие сенесцентных изменений в почках возрастных лабораторных крыс.

Материалы и методы

В эксперименте были использованы самцы белых беспородных лабораторных крыс ( n = 44) старше 18 месяцев («пожилые» или «возрастные», массой тела 365–374 г) [22]. Животные были предоставлены виварием лаборатории физиологии, морфологии, генетики и биоме

дицины Астраханского государственного университета (Россия, Астрахань). Исследование проводили в соответствии с «Положением о содержании и использовании лабораторных животных в Астраханском государственном медицинском университете (заключение локально-этической комиссии № 6 от 27.11.2018)», соответствует этическим стандартам, изложенным в Хельсинской декларации (версия 2013 г.) и рекомендациям Совета Европейского Союза 2010/63/EC. Обезболивание производили препаратом «Амелотекс» («Сотекс»): 0,2 мг на 1 кг массы тела. Для наркоза использовали золетил + ксилазин («Nita-Farm»): 1 мл + 0,1 мл на 1 кг массы тела. Выводили из эксперимента созданием пневмоторакса.

Животные были разделены на 4 группы, по 11 особей в каждой: контрольная; с введением H2S; c введением CsA; и комбинированного воздействия (H2S + CsA). H2S (раствор 10 %-го сульфида натрия) вводили один раз в сутки внутрибрюшинно в течение 10 дней. Такая концентрация соответствует 0,26 мМ H2S, что превышает физиологический уровень в плазме крови животных более чем в 3 раза. CsA «Сандиммун–Неорал» (Novartis, Швейцария) вводили внутрибрюшинно в дозе 20 мг/кг массы тела в течение 25 дней. Дозировки H2S (0,26 ммоль/сут) и CsA (20 мг/кг/сут) были выбраны на основе опубликованных данных, демонстрирующих их способность вызывать стойкий оксидативный стресс у крысмоделей без летального исхода [23, 24].

Фрагменты ткани почек вырезали вертикальным разрезом через ворота, верхний и нижний полюсы, а также наружный край органа. После фиксации в 4 % растворе параформальдегида и гистологической проводки препаратов изготавливали парафиновые срезы в 4–6 мкм толщиной для окрашивания гематоксилином и эозином, проведения ШИК-реакции и иммуногистохимического выявления TGF-β1.

Окрашивание на TGF-β1 проводили следующим образом[1] . После депарафинизации срезов осуществляли восстановление антигенов при 85 °C в 10 ммоль/л цитратном буфере (pH 8,0). Срезы обрабатывали 3 % раствором перекиси водорода для подавления активности эндогенной пероксидазы и блокировали неспецифические связывания с помощью бычьего сывороточного альбумина. Инкубацию проводили первичными поликлональными кроличьими антителами к TGF-β1 (Affinity Biosciences, Китай) в разведении 1:200 в течение 8 часов при 4 °C. После промывки фосфатным буферным раствором срезы инкубировали с вторичными антителами к IgG кролика (Cloud-Clone Corp., Китай). Визуализацию иммунопозитивного материала выполняли с использованием 3,3’-диаминобензидина, после чего проводили контрастное окрашивание гематоксилином ядер клеток. Для подтверждения работоспособности антител и характера окрашивания в качестве положительного контроля использовали срезы фиброзно измененной ткани печени. Отрицательный контроль выполняли путем замены первичных антител на фосфатно-солевой буфер.

Количественную оценку экспрессии маркера TGF-β1 проводили при помощи световой микроскопии и системы автоматической идентификации клеток и сегментации программы QuPath версии 0.6 (Queen’s University Belfast, Великобритания). Подсчитывали долю TGF-β1 положительных клеток в 5 полях зрения участков коркового и мозгового вещества почки. Результат выражали в процентах. Для разделения уровней экспрессии использовался метод медианы. Все поля зрения, в которых осуществляли подсчет были ранжированы по значениям средней оптической плотности в QuPath, результатом стало выделение двух групп: слабоположительные и сильноположительные.

Статистический анализ полученных результатов проводили в LibreOffice Calc (The Document Foundation, Германия). Поскольку данные не соответствовали требованиям нормальности и содержали выбросы, для описания и сравнения групп был использован непараметрический критерий Краскела Уоллиса.

Результаты

Моделирование патологического старения путем изолированного или совместного введения H2S и CsA сопровождалось структурными изменениями в почках, выявленных при морфологическом и иммуногистохимическом анализе.

В контрольной группе наблюдалось сохранение гистоархитектоники клубочков и канальцев почек, а также интерстициальной ткани, выявлялась нормальная структура эпителиальной выстилки без признаков воспаления или некроза. Общее окрашивание на TGF-β1 было незначительным и слабоположительным. Оно чаще всего затрагивало эпителий проксимальных извитых канальцев (рис. 1, б ; рис. 2, в ), отдельные клетки капсулы клубочка (рис. 1, б ; рис. 2, б ), тромбоциты и/или эритроциты в просвете мелких сосудов (рис. 1, в ; рис. 2, в ).

a в клетках мезангия клубочков; б эпителия канальцев; в интерстиции крыс контрольной группы

В группах, получавших исключительно H2S или CsA, отмечалось незначительное расширение канальцев, в отдельных случаях с наличием белкового детрита в их просвете, более характерным у крыс, получавших CsA. В группе, получавшей H2S, наблюдался умеренный интерстициальный отек, локализованный преимущественно в перигломерулярной зоне. В группе CsA имели место локальный тубулоинтерстициальный фиброз, очаги воспалительной инфильтрации (рис. 3, б ; рис. 4, б ).

Как изолированное воздействие H2S, так и CsA вызывало увеличение доли TGF-β1 иммунопозитивных клеток в паренхиме почек (табл. 1).

Примечание : Ме медиана.

Доля TGF-β1-иммунопозитивных клеток в клубочках увеличивалась незначительно после воздействия CsA (медиана = 0,72 % [0,71–0,80]), и статистически не отличалась от контроля ( p = 0,42). При комбинированном воздействии доля TGF-β1 иммунопозитивных клеток была в 2,88 раза выше ( p < 0,05). Среди положительных к TGF-β1 клеток в пределах почечного тельца преобладала цитоплазматическая локализация белка. Морфологически во всех группах наблюдались отдельные склерозированные клубочки, что отражает типичные сенильные изменения паренхимы у крыс старше 18 месяцев. Наиболее выраженные изменения были в группе действия H2S: они сопровождались гипертрофией и увеличением толщины мембраны капсулы Шумлянского Боумена (рис. 3, а ). В группе комбинированного воздействия H2S и CsA наблюдались иммунопозитивные эритроциты и активированные тромбоциты в просвете интерлобулярных артериол (рис. 3, б ).

Рис. 4. TGF-β1-позитивный материал в цитоплазме эпителия петли нефрона

и дистальных извитых канальцев нефрона (указано стрелками), группа H2S ( а ), ×200. ШИК-реакция: утолщение базальных мембран почечных канальцев и аморфный

белковый детрит в их просвете, группа CsA ( б ), ×200. Слабоположительная окраска канальцев коркового вещества, собирательных трубочек (указано стрелками), некроз канальцев почек, группа комбинированного воздействия ( в ), ×200

При микроскопическом исследовании почечных клубочков образцов комбинированного воздействия обнаружено расширение мезангиального матрикса и просвета канальцев, интерстициальный отек, скопление белка в просвете канальцев. В проксимальных отделах нефрона у одних животных появились признаки локального некроза, а у других выявлялся фокальный сегментарный гломерулосклероз (рис. 5).

Локализация TGF-β1-позитивного материала в проксимальных извитых канальцах почек вне зависимости от группы и условий приходилась на цитоплазму, представляя локальные скопления разной интенсивности и плотности. При воздействии H2S (рис. 4, a ), CsA (рис. 4, б ) или их комбинации (рис. 4, в ) доля сероводорода, экспрессия TGF-β1-позитивных клеток в почечных канальцах возрастала в 6,86 раза, 7,23 раза и 13,48 раза соответственно (все p < 0,05). В комбинированной группе отмечено увеличение доли TGF-β1-иммунопозитивных клеток в клубочках в 4,4 раза ( p < 0,05), что согласуется с хорошо известной профибротической ролью этого цитокина в мезангиальных клетках клубочков.

Повышенный уровень TGF-β1 по данным иммуногистохимического анализа и количество положительных клеток при воздействии H2S увеличивалось в 1,89 раза, при воздействии CsA в 1,54 раза, при комбинированном воздействии в 9,15 раза (все p < 0,05). Сверхфизиологическое воздействие H2S (рис. 5, a ), в особенности комбинированное действие H2S и иммунодепрессанта (рис. 5, в ), активно вовлекало интерстиций в патологические процессы, вызывая отек, локальный некроз, выраженный фиброз и дилатацию микрососудистого русла (рис. 5, б ).

Обсуждение

Иммуногистохимический анализ гистологических препаратов выявил увеличение числа TGF-β1 положительных клеток в петле нефрона, дистальных извитых канальцах и собирательных трубочках, что указывает на преимущественную локализацию начала фибротических процессов в канальцах нефрона. При комбинированном воздействии H2S и CsA паренхима почки подвергается наиболее выраженной деградации: интенсификация интерстициального фиброза, выраженный некроз эпителия канальцев, склероз клубочков и компенсаторная гипертрофия сохраненных нефронов все эти признаки прогрессирующего поражения, некоторые из которых частично модулируются TGF-β1.

Эти наблюдения подчеркивают ключевой момент: одновременное применение H2S и CsA многократно усиливает TGF-β1 зависимые пути по сравнению с моновоздействием, создавая условия для фибротического ремоделирования паренхимы. Прогрессирующее накопление TGF-β1 позитивных клеток в канальцах и интерстиции нефронов коррелирует с ускорением клеточного старения, при этом TGF-β1 выступает как инициатор, так и поддерживающий компонент SASP, что согласуется с данными о его роли в патогенезе фиброза [25, 26].

Гипотеза, основанная на концепции клеточной сенесценции, предоставляет последовательную механистическую основу для интерпретации наших наблюдений. Известно, что хроническое воздействие CsA приводит к повреждению митохондрий и образованию активных форм кислорода, запуская сенесценцию эпителия канальцев через механизм окислительного стресса [25]. H2S, хотя традиционно рассматривается как цитопротектор, может модулировать процессы сенесценции посредством окислительно-восстановительно-зависимых посттрансляционных модификаций, таких как S-сульфогидратация ключевых сигнальных молекул [26]. В присутствии циклоспорина А H2S может дополнительно усиливать окислительный стресс и стабилизировать комплекс Smad, передающий сигналы TGF-β1.

Важно отметить, что TGF-β1 является известным индуктором сенесценции в клетках почечных канальцев [27] и центральным компонентом SASP, ассоциированного со старением, который включает и секрецию профибротических цитокинов, стимулирующих формирование белков внеклеточного матрикса. Таким образом, повышение уровня интерстициального TGF-β1 в группе комбинированного воздействия, вероятно, отражает выраженный SASP, исходящий от сенесцентных фибробластов и эпителия канальцев, что усиливает фиброгенез в корковом и мозговом веществе почек.

В почечных клубочках, хотя и выявлялись менее выраженные изменения по сравнению с канальцами и интерстицием, также показано устойчивое увеличение доли TGF-β1позитивных клеток, в особенности в группе комбинированного воздействия. Это, вероятно, связано с относительно короткими сроками эксперимента, поскольку фиброз клубочков обычно развивается в ответ на деградацию проксимальных и дистальных канальцев нефрона. Незначительное увеличение, наблюдаемое при изолированном воздействии H2S (≈1,1–1,3 %), позволяет предположить, что H2S может повышать чувствительность мезангиальных клеток клубочков к стимулам, вызывающим сенесценцию, возможно, за счет повышения экспрессии p21 и p16 через сигнальный путь Smad [15]. Напротив, воздействие CsA вызывает лишь статистически неразличимое от контроля увеличение доли TGF-β1 в мезангии клубочков ( p = 0,42), что согласуется с представлением о том, что повреждение канальцев предшествует фиброзу клубочков при нефротоксичности CsA [28].

В совокупности полученные данные указывают на то, что комбинированное применение донора H2S и CsA сопровождается усилением экспрессии TGF-β1 и развитием профибротических изменений в почечной ткани. Поскольку TGF-β1/Smad-сигнализация ассоциирована с регуляцией клеточной сенесценции и секрецией провоспалительных факторов, полученные результаты позволяют предположить участие сенесценции-ассоциированных механизмов в формировании фиброза паренхимы почки.

В дополнение для установления причинно-следственной связи между уровнем TGF-β1 и индукцией фиброгенеза необходимо применение фармакологической блокады пути Smad, а изучение всего спектра SASP-факторов позволит дать исчерпывающую оценку роли этой сигнальной системы в развитии почечной сенесценции.

Заключение

В ходе исследования показано, что применение донора H2S и CsA, особенно в комбинации, сопровождается достоверным повышением экспрессии TGF-β1 и развитием профибротических изменений в почечной ткани крыс. Наиболее выраженный эффект комбинированного воздействия проявлялся в увеличении доли TGF-β1-позитивных клеток в эпителии проксимальных и дистальных канальцев (более чем в 13 раз) и в интерстиции (более чем в 9 раз) по сравнению с контролем, что коррелировало с морфологическими признаками тубулоинтерстициального фиброза, отека и повреждения эпителия.

Выявленные морфологические изменения утолщение базальных мембран, расширение мезангиального матрикса, фокальный сегментарный гломерулосклероз согласуются с известной профибротической ролью TGF-β1. Учитывая, что сигнальный путь TGF-β1/Smad может быть вовлечен в регуляцию клеточной сенесценции и продукции провоспалительных факторов, полученные данные позволяют предположить участие сенесцентно-ассоциированных механизмов в формировании фиброза. Вместе с тем, в рамках настоящего исследования не оценивались прямые маркеры сенесценции (β-галактозидаза, p16Ink4a, p21), поэтому выводы о стимуляции сенесцентного фенотипа требуют дополнительной верификации.

Таким образом, TGF-β1, вероятно, играет важную роль в реализации профибротического ответа при комбинированном воздействии донора H2S и CsA. Результаты подчеркивают потенциальную значимость TGF-β1-зависимых механизмов в патогенезе токсического поражения почек и открывают перспективы для дальнейших исследований, включая оценку маркеров клеточной сенесценции и изучение терапевтических подходов, направленных на модуляцию фиброгенных путей.